复杂代谢途径的高效重编程是构建高性能微生物细胞工厂的重要挑战。枯草芽孢杆菌作为具有GRAS安全认证的工业底盘菌，在蛋白质、维生素及类胡萝卜素等高附加值产物的生物制造中具有应用前景。然而，实现多基因精细调控以优化复杂代谢网络面临技术瓶颈，传统的质粒文库或启动子/RBS替换方法难以在染色体原位实现多基因同时、精准、可扩展的调控，限制了其在代谢通路系统优化中的应用。近日，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员王猛团队基于前期开发的碱基编辑平台BETTER，建立了枯草芽孢杆菌的多位点碱基编辑系统bsBETTER，实现了在枯草芽孢杆菌中对12个关键代谢基因同时调控，并在每个基因位点上获得了256种理论核糖体结合位点组合中的255种变体，拓展了多基因表达调控的深度与分辨率。研究以番茄红素合成为模型通路，靶向调控MEP途径及下游合成模块的12个关键基因，通过碱基编辑在染色体原位构建高多样性核糖体结合位点文库，并结合高通量筛选和深度测序，获得了番茄红素产量提升6.2倍的工程菌株。多组学分析表明，bsBETTER介导的多基因协同调控重构了MEP通路的代谢通量与氧化还原辅因子平衡，增强了糖酵解、磷酸戊糖途径和TCA循环的整体代谢活性，提高了NADPH与ATP的再生能力，实现了系统层面的代谢重编程。研究同时揭示了不同基因核糖体结合位点强度的上下游依赖关系：上游限速酶基因保持中低表达更利于代谢平衡，下游关键合成酶的高强度表达可有效促进产物积累。研究为进一步提升筛选与验证效率，建立了两个自动化高通量平台体系。一是番茄红素高通量筛选平台，实现了从孔板发酵、自动化萃取到HPLC/UPLC-MS定量分析的全流程集成，可快速完成上万株突变体的并行筛选与验证，提升了表型检测通量和结果准确性；二是基于CRISPR的自动化基因组编辑与验证平台，可实现从编辑质粒设计与构建、突变体构建、质粒清除到菌株培养及荧光验证的全自动化操作，提高了多基因编辑效率与重现性，为复杂代谢调控提供了标准化工程基础。相比于传统的启动子工程或CRISPRa/i方法，bsBETTER无需外源供体模板、不依赖重组、无双链断裂，具有高效率、强宿主适配性与可扩展性等优势，为多基因通路的优化和系统重构提供了新技术路径，有望推广应用于维生素、色素、脂肪酸及多肽等多类高附加值化合物的生物制造过程。相关研究成果在线发表在《代谢工程》（Metabolic Engineering）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项的支持。论文链接自动化高通量平台体系